AcrVA5에 의한 Cas12a 활동의 가역적 규제

Cell Discovery 8권, 기사 번호: 45(2022) 이 기사 인용

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친애하는 편집자에게,

클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복(CRISPR)/CRISPR 관련(Cas) 시스템은 박테리오파지와 같은 이동 유전 요소(MGE)로부터 박테리아와 고세균을 보호합니다1. Cas 이펙터는 CRISPR RNA(crRNA)에 의해 유도되어 염기쌍을 통해 침입하는 핵산을 표적으로 삼은 다음 표적을 절단하여 숙주에게 면역력을 제공할 수 있습니다2,3. 숙주 CRISPR 시스템에 의해 부과된 면역 압력에 대처하기 위해 파지는 Cas 뉴클레아제를 비활성화하고 차례로 숙주 면역 시스템을 닫는 다양한 종류의 항-CRISPR(Acr) 시스템을 진화시켰습니다4. Acr 단백질은 Cas 단백질과 직접 상호작용하여 crRNA 로딩 또는 표적 결합을 방지할 수 있습니다. 대안적으로, 이들은 crRNA를 절단하거나 번역 후 Cas 단백질을 변형시키는 효소 활성을 보유합니다4. 그 중에는 최근 보고된 GNAT 계열 아세틸트랜스퍼라제, 즉 AcrVA5가 존재하며, 이는 MGE에 의해 인코딩되고 주요 라이신 부위의 아세틸 변형을 통해 유형 VA Cas12a 이펙터를 특이적으로 억제합니다. AcrVA5가 비활성화된 Cas12a는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 부위와 상호작용하는 능력을 상실하고 침입하는 MGE를 절단하여 숙주를 보호하는 데 실패합니다. Cas12a 시스템을 비활성화함으로써 acrVA5 유전자를 포함하는 MGE는 박테리아 면역 시스템을 효과적으로 차단할 수 있으며 Cas12a 보유 숙주 사이에 널리 퍼질 가능성이 있습니다. 그러나 놀랍게도 acrVA5 유전자는 데아세틸라제를 잃은 3개의 Moraxella bovoculi 균주에만 존재합니다(보충 표 S1). 따라서 아세틸트랜스퍼라제 AcrVA5와 광범위하게 분포된 박테리아 탈아세틸화효소7 사이에 경쟁 관계가 존재할 수 있다고 의심하는 것이 합리적입니다. 이는 acrVA5 카세트를 보유하는 MGE의 침입으로부터 숙주를 보호하기 위해 탈아세틸화에 의해 Cas12a를 재활성화할 수 있습니다.

우리는 먼저 AcrVA5 매개 시험관 내 아세틸화 실험을 수행하여 AcrVA5 아세틸화 Lachnospiraceae 박테리아(Lb) Cas12a가 이중 가닥 표적 DNA(dsDNA)에 대한 cis 및 trans 절단 활성을 모두 상실했음을 보여주었습니다(보충 그림 S1a, b) 이는 이전 연구 결과와 일치하지만 AcrVA5 처리는 표적 단일 가닥 DNA(ssDNA)에 의해 유발될 때 LbCas12a 절단 활성에 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다(보충 그림 S1c). PAM 사이트는 Cas12a가 표적 dsDNA를 인식하는 데만 필요하고 ssDNA8은 인식하지 못하기 때문에 위의 결과는 AcrVA5 매개 아세틸화가 Cas12a가 표적 dsDNA5의 PAM 서열과 상호 작용하는 것을 방지한다는 것을 추가로 확인시켜 주었습니다.

LbCas12a 외에도 Francisella tularensis subsp.의 Cas12a 오솔로그도 분석했습니다. novicida(FnCas12a) 및 Acidaminococcus sp. (AsCas12a) AcrVA5가 두 오르토로그를 모두 비활성화할 수 있음을 입증했습니다(보충 그림 S2 및 S3). 눈에 띄게 AcrVA5는 이전 연구에서 AsCas12a에 대해 효과가 없는 것으로 나타났습니다6. 그러나 AsCas12a가 보존된 라이신 잔기를 포함하고 있음을 발견했으며(보충 그림 S3c) AcrVA5 매개 치료가 cis- 및 표적 dsDNA를 이용한 AsCas12a의 절단 활성.

번역 후 라이신 아세틸화는 박테리아에서 인간에 이르기까지 유기체의 다양한 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다9. 박테리아에서 NAD+ 의존성 시르투인형 CobB는 다수의 단백질을 탈아세틸화하고 전반적인 아세틸화 수준을 조절합니다7. CobB가 AcrVA5 처리된 Cas12a를 탈아세틸화하고 시스 및 트랜스 절단 활성을 재활성화할 수 있는지 테스트하기 위해 재조합 대장균 CobB 및 LbCas12a를 정제하고 시험관 내 탈아세틸화 분석을 수행했습니다. 웨스턴 블롯 결과에 따르면 Cas12a는 아세틸-CoA 존재 하에서 AcrVA5에 의해 성공적으로 아세틸화되었으며, 아세틸 변형은 CobB에 의해 처리된 후 효율적으로 제거될 수 있었습니다. 이전 연구 결과와 일치하여 CobB 매개 탈아세틸화는 NAD+를 보조 인자로 엄격히 요구합니다(보충 그림 S4). 따라서 AcrVA5-아세틸화 LbCas12a는 표적 dsDNA와의 cis-절단 및 trans-절단 활성을 모두 잃었지만 CobB에 의해 탈아세틸화된 후에 두 활성을 상당 부분 회복했습니다(그림 1a, b). 또한 FnCas12a 및 AsCas12a와 같은 여러 Cas12a 오솔로그를 테스트한 결과 CobB가 두 Cas12a 오솔로그를 모두 탈아세틸화하고 재활성화할 수 있음을 발견했습니다(보충 그림 S5-S8). CobB 처리에 의한 아세틸화 AsCas12a의 성공적인 재활성화는 AsCas12a가 AcrVA5의 표적으로 다시 한 번 입증되었지만(보충 그림 S3), 이 연구와 이전 연구 사이의 뚜렷한 결과에 대한 이유는 아직 알려지지 않았으며 추가 조사가 필요한 흥미로운 질문이 될 것입니다. 위의 결과를 바탕으로 AcrVA5와 CobB가 시험관 내에서 Cas12a의 아세틸 상태를 조절하여 Cas12a의 cis- 및 trans-절단 활성을 가역적으로 조절한다는 결론을 내릴 수 있습니다.