생리학적 조건 하에서 인간 장 환경 프로파일링

Nature 617권, 581~591페이지(2023)이 기사 인용

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인간 미생물군집1,2, 프로테옴3 및 대사체4,5의 시공간 구조는 국소 장 생리학을 반영하고 결정하며 질병에 영향을 미칠 수 있습니다6. 그러나 대변 샘플에 의존하고 단식 또는 진정된 개인의 내시경 검사를 사용하여 장의 일부 영역에만 접근하는 것이 제한되어 있기 때문에 장내 미생물의 분포, 환경 및 생화학적 활동에 대해 알려진 바가 거의 없습니다7. 이러한 결함을 해결하기 위해 우리는 정상적인 소화 중에 인간 장관의 여러 영역에서 샘플을 수집하는 섭취 가능한 장치를 개발했습니다. 장치를 사용하여 15명의 건강한 개인으로부터 240개의 장 샘플을 수집하고 후속 다중 오믹스 분석을 통해 장과 대변의 박테리아, 파지, 숙주 단백질 및 대사 산물 사이의 중요한 차이가 확인되었습니다. 특정 미생물 분류군은 차별적으로 풍부했으며 프로파지 유도는 대변보다 장에서 더 널리 퍼졌습니다. 숙주 단백질체와 담즙산 프로필은 장을 따라 다양하며 대변의 프로필과 매우 다릅니다. 담즙산 농도의 구배와 미생물 풍부도 사이의 상관관계는 탈접합을 통해 담즙산 풀을 변화시키는 종을 예측했습니다. 더욱이 미생물에 결합된 담즙산 농도는 대변에서는 나타나지 않는 아미노산 의존적 경향을 나타냈습니다. 전반적으로, 생리학적 조건 하에서 장관을 따라 미생물, 단백질 및 담즙산을 비침습적으로 종단적으로 프로파일링하는 것은 인간 생리학 및 질병에서 장내 미생물군집 및 대사체의 역할을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

인간의 장에는 우리 몸 안이나 몸에 서식하는 대부분의 미생물이 서식하고 있습니다1. 그들의 유전적 내용과 생화학적 변형 능력은 인간 게놈에 의해 암호화된 것보다 수백 배 더 큽니다8. 인간은 다른 중요한 기능 중에서도 음식 소화, 면역체계 조절, 병원체로부터의 보호를 위해 장내 미생물에 의존합니다1. 장의 중요하지만 종종 간과되는 측면은 지역적 이질성과 그것이 지역 생리학에 미치는 영향입니다9. 장관에 접근하고 샘플링하는 데 어려움이 있기 때문에 대변은 인간 장내 미생물 연구에 대한 주요 정보 소스였습니다10. 그러나 대변은 폐기물과 하류 유출물을 반영하며, 그 안에서 지역적 변화는 사라집니다. 예를 들어, 담즙산과 같은 주요 대사산물은 미생물 변형에 의해 상류에서 변경된 다음 배설되기 전에 숙주에 의해 실질적으로 흡수됩니다4. 위장 원위부(십이지장, 공장, 회장 및 결장)의 영양 가용성, pH, 산소 분압, 점막 구조 및 유속이 현저하게 다릅니다7. 결과적으로, 각 장 영역3,4,11에는 전문화된 기능, 대사체, 면역 틈새 및 프로테옴을 가진 뚜렷한 미생물 군집이 존재합니다. 따라서 장내 미생물이 인간 생리학에 어떻게 영향을 미치고 그 반대의 영향을 미치는지에 대한 더 깊은 이해를 위해서는 교란되지 않은 자연 상태에서 장내 미생물군집과 그 화학적 환경에 대한 국소 샘플링이 필요합니다.

역사적으로 교란이나 오염 없이 인간의 장을 샘플링하는 것은 어려운 일이었습니다10. 우리는 최근 사망한 장기 기증자의 장 전체에서 단지 몇 인치의 공간적 규모에 걸쳐 미생물군 구성의 상당한 지역적 다양성을 발견했습니다2. 그러나 장기 기증자는 일반적으로 항생제 치료를 받아 왔으며, 생명유지 중단 직후 장관에서 샘플을 채취한 경우에도 장은 종종 허혈성 또는 괴사성이었습니다. 상부 내시경 검사를 사용하여 살아있는 개인의 십이지장 샘플링은 구강, 식도 또는 위 내용물로 인한 부주의한 오염 가능성이 높습니다. 공장 중앙에 내시경으로 접근하려면 금식12,13에서 수행되는 전신 마취 또는 진정과 관련된 ~2시간 절차가 필요합니다. 또는 복벽을 통해 회장을 외부화하여 장루를 삽입하여 장 샘플을 제공할 수 있지만 이 절차는 침습적이며 단일 위치에서 변형된 장 해부학 및 생리학을 반영합니다14. 담즙산의 미생물군집 및 신호 특성에 대한 중요한 영향에도 불구하고 담즙산의 화학적 다양성 및 농도에 대한 연구는 대변 내 담즙산의 몇 퍼센트 또는 혈액 내 몇 퍼센트의 비대표적인 측정에 의존해 왔습니다. 인간의 장 샘플링을 위해 이전에 개발된 섭취 가능한 장치에는 복잡한 전자 장치15, 장치 유지 위험이 있는 큰 크기15 또는 다중 오믹스 분석을 위한 샘플링 볼륨이 충분하지 않은 등 중요한 제한 사항이 있습니다. pH 프로필, 연동운동, 식이, 생리학, 위장 장애 및 담즙산과 같은 주요 대사물질17은 인간과 동물 사이에 현저한 차이가 있어18 인간 연구는 인간의 생리학 및 질병과 가장 관련성이 높습니다.

0.75 between devices and stool that were significantly differentially abundant (n = 28 ASVs across n = 268 analysed samples; limma-voom was used to calculate differential expression after size factors were estimated and normalized using DESeq2; P < 0.05, Benjamini–Hochberg correction)./p> 0.75) in intestinal samples than in stool (Fig. 1f). The Romboutsia genus was recently named following isolation of a species from rat ileal digesta26, in line with this genus having a niche in the small intestine./p>40% (Fig. 2c). Consequently, individual intestinal samples contained communities with lower alpha diversity relative to the intra-individual diversity represented by all samples from a device of a certain type or by all samples from devices swallowed at the same time (Fig. 2d and Extended Data Fig. 3b,c). Thus, much of the higher variability across intestinal samples relative to stool is probably due to the dynamic and heterogeneous nature of the microbiota along the intestinal tract./p>75% complete and <25% contamination) from these data (Methods and Supplementary Table 3), which enabled taxonomic identification for read-mapping applications. On the basis of the established role of the gut microbiota in carbohydrate degradation and its links to health and disease27, we first focused on carbohydrate active enzyme (CAZyme) gene abundance in each region. The percentage of reads that mapped to CAZymes in devices exhibited greater variance than in stool (Extended Data Fig. 5a,b). Within devices, CAZyme gene abundance was positively correlated with the relative abundance of five ASVs: two unnamed Bacteroides species, two Bacteroides vulgatus strains and Parabacteroides merdae (P < 0.001, Benjamini–Hochberg corrected; Extended Data Fig. 5c). The B. vulgatus strains exhibited the highest slope and strongest correlation (Spearman's ρ = 0.77 and 0.75). By contrast, in stool, despite a correlation between the abundance of CAZyme genes and the Bacteroidaceae family (Extended Data Fig. 5d), there were no ASVs whose abundance correlated with CAZyme gene abundance, probably because of the greater evenness of the taxa observed in stool compared with intestinal samples (Fig. 2c)./p>95%; Supplementary Table 2) from this library showed that the 35 members of the Bacteroidetes phylum typically contained more CAZyme genes than members of other phyla (Extended Data Fig. 5e). The dataset included ten Parabacteroides strains (eight Parabacteroides distasonis and two P. merdae). Each CAZyme gene was annotated with a CAZyme enzyme class and family to give a putative functional category. The CAZymes detected in the P. merdae strains were assigned to a mean of 107.5 unique CAZyme functional categories out of a mean of 237.5 CAZymes, and P. distasonis enzymes were assigned to 95 unique CAZyme functional categories out of a mean of 237.5 CAZymes; thus, P. distasonis strains appear to contain greater redundancy than P. merdae strains (Supplementary Table 4). Furthermore, P. merdae strains contained seven additional unique CAZyme functional categories in the glycoside hydrolase family and five additional unique polysaccharide lyase functional categories compared with P. distasonis strains (Supplementary Table 4). We also investigated five strains of B. vulgatus: each possessed 301 or 302 CAZyme genes representing 131 unique functional categories, more than in any other non-Bacteroides isolate (Extended Data Fig. 5e and Supplementary Table 4). However, B. vulgatus was the Bacteroides species with the fewest CAZyme genes (Extended Data Fig. 5e and Supplementary Table 4), indicating that factors other than CAZyme abundance influence the dominance of B. vulgatus over other Bacteroides species in the intestines. These differences in CAZyme gene abundance and functional categories are an important consideration for how diet drives the growth of certain bacteria in the gastrointestinal tract and for which by-products of carbohydrate degradation may be available to the host./p>50% completeness, of which 629 were integrated prophages (Methods). Of these vOTUs, 83% (1,343/1,607) were present in both stool and intestinal samples (Fig. 3a), indicating that the intestines and stool have similar viromes. The abundance of these vOTUs as determined by read mapping was generally correlated between intestinal and stool samples (Extended Data Fig. 6a), although the intestinal samples had higher viral read mapping fractions (Extended Data Fig. 6b), perhaps owing to lower bacterial densities1. Viromes were more similar between stool and intestinal samples from the same participant (Jaccard distance of 0.40 ± 0.14, mean ± s.d.) than between stool (0.58 ± 0.09) or intestinal (0.62 ± 0.10) samples from different participants (P < 10−10 in both cases, two-tailed Student's t-test), and PCoA of the viromes (Fig. 3b) showed similar clustering as with the microbiota (Fig. 1e)./p> 1 and P < 0.05 are coloured on the basis of sample type and enrichment. c, PCA of normalized human protein abundance shows separation between intestinal and stool samples (n = 212 and 56, respectively). d, Human proteome composition varies significantly more between intestinal samples (n = 212) than between stool samples (n = 56), both within (top) and across (bottom) participants. Top, each circle is the median Pearson correlation coefficient of all sample pairs for a given participant. Bottom, each circle is the median of all correlation coefficients between all pairs of samples from any two participants (n = 105 for each intestinal and stool sample). ****P ≤ 0.0001, Bonferroni-corrected two-tailed Wilcoxon rank-sum test. e, PCA from c highlighting the clustering of intestinal and stool samples from participant 15 (n = 15 and 4, respectively). f, Canberra distance between microbiota compositions was higher in samples with less similar human proteomes for all sample pairs of a given type (n = 20,706 pairwise comparisons for devices, n = 1,485 pairwise comparisons for stool)./p>90% and contamination of <10%, dereplicated to 99% average nucleotide identity (ANI)) and searched for the canonical BSH gene in each using a hidden Markov model. We found putative BSH genes in A. hadrus (7 of 8 MAGs) and A. putredinis (4 of 4 MAGs), in accordance with previous literature38. By contrast, none of the 12 F. prausnitzii MAGs nor the 3 B. wadsworthia MAGs contained any putative BSH genes, suggesting that these taxa may use glycine and taurine25 generated by other microbial deconjugation reactions./p>50 µl of intestinal fluids and were subjected to DNA extraction and 16S rRNA gene and metagenomic sequencing; the remainder sampled <50 µl or were filled with gas, most likely from the colon./p>50 µl, DNA was extracted using a Microbial DNA extraction kit (Qiagen)43 and 50 µl from a device, 200 µl of saliva or 100 mg of stool./p>2,500 reads were retained for analyses. We obtained sufficient sequencing reads from 210 samples, which were the focus of subsequent analyses, along with sequencing data from 29 saliva and 58 stool samples (one participant provided only one saliva sample, and one stool sample had insufficient sequencing reads; Extended Data Fig. 2a)./p>75% completeness and <25% contamination were dereplicated at 99% ANI (strain level) with dRep (v.3.0.0)58, resulting in 696 representative MAGs across all samples. GTDB-Tk was used to assign taxonomy59. Default parameters were used for all computational tools./p>90% coverage and dereplicated to create a curated database of AMR genes. Metagenomic reads for each sample were mapped against this database to calculate the percentage of reads mapped./p>1 kb in length were analysed using VirSorter2 (ref. 65), DeepVirFinder66 and VIBRANT67. Contigs identified as viral by at least one algorithm (VirSorter2 score ≥0.9, or DeepVirFinder score ≥0.9 and P < 0.05, or VIBRANT score of medium quality or higher) were clustered using an ANI cut-off of 0.95 and coverage cut-off of 85%. The quality of the clustered contigs was analysed using CheckV68, which also classified viral contigs as prophages if they contained both viral and bacterial regions./p>2 and the prophage region has >50% coverage./p> 0.995 for all bile acids), and the model was applied to all samples and blanks to calculate concentrations. The average concentration reported for method blanks was subtracted from sample concentrations. Because multiple dilutions were analysed for each sample, the measurement closest to the centre of the standard curve (750 ng ml–1) was used. Zero values were imputed with a concentration value between 0.001 and 0.1 ng ml–1. Concentrations were reported as ng ml–1 for intestinal sample liquid supernatant and ng g–1 for wet stool. In all, 218 device samples and 57 stool samples passed quality control and were used for analyses (Extended Data Fig. 2a)./p>